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    公开号:WO1992017500A1
    申请号:PCT/JP1992/000372
    申请日:1992-03-26
    公开日:1992-10-15
    发明作者:Shuhei Kondo；Kohei Ogawa
    申请人:Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明細書
    [0002] 新規な巨核球増幅因子およびその製造方法 技術分野
    [0003] 本発明は新規な巨核球増幅因子およびその製造方法に関す る。 更に詳しく は、 本発明は、 血小板の前駆細胞である巨核 球の増幅を促進する活性を有し血小板産生を促進する作用を 有する新規な巨核球増幅因子蛋白質、 および細胞培養または 遺伝子工学的技術によるその製造方法に関する。 本発明はま た、 血小板減少症等の疾患の予防及び治療に有用な巨核球増 幅因子と しての上記の新規な蛋白質を含む医薬組成物に関す る。
    [0004] 背景技術
    [0005] 血小板は、 血管の破れによって起こる出血を生体が自然に 止める血栓形成および血液凝固の過程において、 その促進に 重要な働きを担っている。 血小板の産生を特異的に促進する 因子と される ト ロンボポェチン （ T P O ) は、 過去 20年以上 もの間数多く の研究者がその取得に情熱を燃やして当ってき ているが、 いまだに成功にはいたっていない。
    [0006] 血小板減少動物の血しょ う を健常動物に投与する と、 血小 板産生がこ う進し、 逆に血小板を輪注する と血小板産生が低 下するこ とから、 血小板の増減に応じてその産生を調節する 作用を有する T P〇の存在が古く から提唱されてきた。 その 後の-研究結果から、 血小板は骨髄幹細胞から巨核球前駆細胞 を経て骨髄中で分化 · 成熟して生じた巨核球よ リ血液中に放 出されるこ とが明かにされ、 また i n v i t r oの成績から巨核球 の分化 · 増幅過程の早期には巨核球コ ロニー刺激因子 （Mega karyocyt e Co lony St imu l at ing Factor； Meg-CSF) 力 S作用 し、 後期には巨核球の成熟を促進させる活性を有する T P Oが作 用する こ と も明かにされた。 即ち、 まず Meg - CSFの作用で、 前駆細胞が細胞分裂を繰返し巨核球コンパ一トメ ン トが増大 し、 次に T P Oの作用によってそれぞれの巨核球前駆細胞は endomi tos i sを行ない、 その染色体倍数を增大させていく （ →32N) と共に細胞質が成熟 · 増大して、 血小板産生がなさ れるよ う になる。 T P Oはまた巨核球増幅因子 （Megakaryoc y t e Pot ent i ator； eg-POT) と呼ばれるこ と もある。
    [0007] Meg- CSFの活性は、 in v i t roのヒ トまたはマウスの骨髄細 胞の軟寒天培養において巨核球コ ロニーを形成させる活性を 測定するこ と によ リ det ermi neされる。 現在 Me g - CSFの活性は、 再生不良性貧血患者及び突発性血小板減少性紫斑病患者の尿 中、 骨髄巨核球無形成性血小板減少症患者の血しょ う 中、 ィ ンゲンマメ レクチン刺激ヒ ト 白血球培養上清、 マウス白血病 細胞株 WEHI - 3培養上清等に見いだされている。
    [0008] 種々 のサイ ト力イ ンの う ち、 イ ンターロイ キン 3 ( 1 L - 3) (以下ィ ンターロイキンは ILと略す）が巨核球を含む多く の系 統に非特異的に作用する Mu 1 t i - CSFであるこ とが明 らかとな つてきている。 また WEHI- 3培養上清中の Meg - CSFが IL - 3と完 全に一致するなど、 従来の細胞培養上清中の Meg-CSF活性の 多く が I L-3による と されている。 しかしながら、 血小板系に 特異的に作用するこ とが明らかにされた Meg - CSFは未だに知 られていない。
    [0009] —方 T P Oの活性は、 Meg- CSFのコ ロニー形成活性の増強 作用及び/または巨核球の成熟促進作用を測定するこ とによ リ determineされる。 これまでにいく つかの T P O様活性を 有する因子の提供が試みられてきた。 ヒ ト胎児腎細胞株の培 養上清中よ リ調製される、 SDS- PAGEでの分子量が 15000、 等 電点が 5.1の巨核球系の細胞中の蛋白質合成を促進する作用 を有する巨核球促進因子 （Megakaryocyte St imulatory Fact or ; SF) 及びその製造方法が報告されている （米国特許第 4, 894， 440参照） 。 また最近、 B細胞の抗体産生を誘導する糖 蛋白質と して見いだされ、 免疫系、 急性期反応系及び悪性腫 瘍にも関与するこ とが明らかにされている多機能サイ トカイ ンである IL- 6が、 造血系にも関与してぉ リ 、 in v i t roにおい て Meg-POT活性及び巨核球成熟促進活性を示し （Ishibashi,T. e t a 1. 「Proc.Nat 1. Acad. Sc USA」 5953 ( 1989 ) ) 、 in v i v oにおいて血小板産生促進作用を示すこ とが確認されている (Asano, S. et a 1.「 B 1 o o d」 、 1602 ( 1990) ) 。 更に、 IL- 7や I い Π等も巨核球増幅因子活性を有するこ とが報告されている。 しかしながら、 これらの因子の巨核球增幅因子活性は微弱な ものであ り 、 またこれらが生体に本来備わった構成的（ c 0 n s t ί t u t i v e )な造血因子であるかどう かは不明である。
    [0010] 本発明者等は、 上述の技術的背景にあって、 特異的に且つ 強力に巨核球の増幅を促進する作用及び血小板産生を促進す る作用を有する新規な巨核球増幅因子を見いだすべく鋭意研 究を重ねた結果、 意外にも動物細胞の培養上清中に全く新規 な巨核球増幅因子を発見する と共に、 適当な産生促進剤を培 地に添加するこ とによ リ 、 大量の該因子が生産されるこ とを 見いだした。 更に回収した培養上清よ リ 、 該因子を単離 · 精 製し、 その諸性質を明らかにする と共に、 その薬剤と しての 有用性を示した。 また遺伝子工学的技術を応用 し、 該巨核球 増幅因子を発現させるこ と もできる。 本発明はこれらの知見 に基づいて完成されたものである。
    [0011] 発明の開示
    [0012] したがって、 本発明の 1 つの目的は、 強力な作用を有する 実質的に純粋な新規な巨核球増幅因子を提供するこ とにある。
    [0013] また、 本発明の他の目的は、 動物細胞を培地中にて培養し、 その培養液中に巨核球増幅因子を産生させ、 培養液から培養 上清を回収し、 回収した培養上清から巨核球増幅因子を精製 するこ とを含む巨核球増幅因子の製造方法を提供するこ とに ある。
    [0014] 本発明の更に他の目的は、 上記の細胞培養において培地中 に巨核球増幅因子産生促進剤を添加して細胞培養を行う こ と によ リ 、 産生される該巨核球增幅因子の量を増大させる、 巨 核球増幅因子の製造方法を提供するこ と にある。
    [0015] 本発明の更に他の目的は、 巨核球増幅因子を遺伝子工学的 技術によ り製造する方法を提供するこ と にある。
    [0016] 本発明の更に他の目的は、 治療的に有効な量の巨核球増幅 因子を活性成分と して含有する医薬組成物及びそれを用いた 治療方法を提供するこ とにある。
    [0017] 本発明の上記及びその他の諸目的、 該特徴ならびに諸利益 は、 添付の図面を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請 求の範囲の記載から明かになる。
    [0018] 本発明によれば、 巨核球増幅を活性化する活性を有し且つ 末梢血中の血小板を増加させる活性を有する巨核球増幅因子 が提供される。 更に詳しく は、 巨核球増幅を活性化する活性 を有し且つ下記の諸性質を有する実質的に純粋な巨核球増幅 因子蛋白質が提供される。
    [0019] ( a ) 分子量 ： 2 5， 0 0 0 ± 8， 0 0 0 (ゲル濾過で測定）
    [0020] ： 2 8， 0 0 0 ± 2， 0 0 0 (SDS - PAGEで測定） ( b ) 等電点（ P I ) ： P I 〉 9 (等電点ク ロマ ト グラ フ ィ ー で測定）
    [0021] ( c ) ヒ トのエ リ ト ロポェチン、 イ ンターロイ キン 1 ひ 、 ィ ンターロイ キン 1 /3 、 イ ンターロイ キン 6 及びイ ンターロイ キン 7 に対する各抗体を用いた巨核球増幅因子活性中和試験 において活性が実質的に低下しない。
    [0022] ( d ) 巨核球コ ロニー刺激因子活性を有さない。 上記の ヒ トのエ リ ト ロポェチン、 イ ンターロイ キン 1 α、 イ ンターロイ キン 1 β 、 イ ンターロイ キン 6及びイ ンター口 ィキン 7 に対する各抗体と しては、 米国ジェンザィム社の抗 体を用いるこ とができる （the 1991 Genz yme C a t a I o g； C y t o k i n e Res e a r c P roduc t sノ。
    [0023] また本発明の他の態様によれば、 動物細胞を培地中にて培 養し、 その培養液中に巨核球増幅因子を産生させ、 培養液か ら培養上清を回収し、 回収した培養上清から該巨核球増幅因 子を分離 · 精製するこ とを含む巨核球増幅因子の製造方法が 提供される。
    [0024] 本発明の方法において用いられる動物細胞と しては、 巨核 球増幅を活性化する活性を有し、 且つ末梢血中の血小板を增 加させる活性を有する巨核球増幅因子を産生する能力を有す る各種の細胞を用いるこ とができる。 正常二倍体細胞を有利 に使用でき、 例えば、 ヒ トの腎、 腸、 肺、 心臓、 輸尿管、 皮 膚、 包皮、 舌、 甲状腺、 胎盤、 子宫由来の細胞を、 好ま しく はヒ ト胎児腎、 肺、 包皮由来の細胞を、 更によ リ好ま しく は ヒ ト胎児肺由来の細胞を使用できる。
    [0025] 該巨核球増幅因子は、 これらの組織抽出液から分離精製す るこ と も可能であるが、 よ り好ま しく は、 これらの細胞を適 当な生育培体中で培養し、 その培養液に巨核球増幅因子を産 生させ、 培養液から培養上清を回収し、 回収した組織培養液 から分離精製するこ とができる。 これらの細胞は、 通常の細 胞の培養に用いられる培養方法例えば 「組織培養」 （中井準 之助他編集昭和 5 1 年刊朝倉書店） 記載の方法で増殖させ、 本発明に供するこ とが望ま しい。 細胞は炭素類、 窒素源及び 必要な場合には、 無機塩類及び/またはその他の添加物を含 む培地溶液中で培養するこ と によって、 巨核球増幅因子を生 産せしめるこ とができる。 また、 本発明によれば、 培地中に 巨核球増幅因子産生促進剤、 好ま しく は動物肉酵素分解ぺプ ト ンを添加し、 細胞を培養するこ とによ リ 、 培養液中に産生 される該巨核球増幅因子の量を飛躍的に増大せしめるこ とが できる。 動物用酵素分解ペプ ト ンの濃度と しては培地に対し . 0〜4w/v%、 好ま しく は 0. l〜2w/v%を用いるこ とができ る。 動 物肉酵素分解ぺプ ト ンは、 一般に細菌の培養培地に用いられ る ものでぁ リ 、 通常プロテオー スペプ ト ン、 プロテオーゼぺ プ ト ン、 獣肉ペプ ト ンと呼ばれる ものである。
    [0026] この動物肉酵素分解ペプ トンの調製法は公知でぁ リ 、 例え ば 「細菌培地学講座第二集」 （坂崎利一著、 納谷書店、 1967 年刊） 記載の方法に従えばよい。 即ち、 動物肉 と しては、 牛 豚、 ニヮ ト リ 、 羊、 ク ジラ等の肉または内臓が用いられるが この う ち牛肉が最も普通に用いられる。 分解用の酵素と して は、 ト リ プシン、 パパイ ン、 ペプシン、 ノ ンク レアチン等が ある。 これらの動物肉は、 破砕され、 水と混合され、 炭酸ナ ト リ ゥム、 濃塩酸等で酵素分解に適した P Hに調製される。 これに酵素を加え、 2 0 〜 4 0 °〇で 1 〜 2 0 日 間、 通常は 3 7 °Cで 2 〜 3 日間酵素分解を行なう。 消化後は分解酵素を不 活性化するためと、 未消化の蛋白を熱凝固させるために、 1 0 0 °C以上に加熱し、 濾過によってこれを除去した後、 濃縮、 乾固、 細末化する。 濃縮、 乾固の方法には、 煮つめて粉末に するのと、 真空乾燥装置を用いて低温で濃縮後、 細末化する のがある。 市販品と しては、 米国ディ フコ社製のプロテオ一 スペプ トン No.1 (Prot eose P e p t on No .1 ) 、 プロテオースぺ プ ト ン No.2、 プロテオースペプ ト ン No.3、 チォペプ トン （Th iopepton) 、 英国ォキソィ ド社製のプロテオ一スペプ トン L4 6、 ペプ ト ン PL46、 英国 B B L社製のチオ トン （Th ioton) 、 日本国大五栄養化学社製のプロテオースぺプ トン等がある。 次に、 巨核球増幅因子の細胞培養法による生産の例を示す。 直接組織から取リ 出した核因子を産生する初代培養細胞ある いは市販の細胞を用い、 付着培養あるいは浮遊培養で培養す る。 一例を示せば、 適当な細胞密度、 好ま しく は 105ce l l s/m β の密度で、 0.1〜 10 mg /m £ の細胞培養用ビーズ担体と共に 植込み、 有血清下 15〜45°C、 好ま しく は 25〜40°Cの温度範囲 で、 5〜 9好ま しく は 6〜 8の培養液 pH範囲で、 通常 5%C02を含 む空気中で培養される。 巨核球増幅因子産生促進剤を用いる 場合は無血清条件下と し、 0〜4%好ま しく は 0.1〜 2%の濃度で 添加して生産培養が行なわれるが、 好ま しく は細胞を十分に 増殖させ、 よ リ好ま しく はコンフルェン トの状態で生産培養 に移される。 生産の培養日数は通常 1〜60日であるが、 60日 を越えるこ と も可能である。 巨核球増幅因子の生産速度は、 生産の後半においては次第に遅く なるので、 工業的生産の場 合には最も効率のよい日数が選ばれる。 巨核球増幅因子は、 前記の条件下で細胞から溶液中に産生される。 その生成量の 測定は、 参考例 1 ( a ) ， ( b ) に示した巨核球増幅因子活 性測定法で行ない、 その巨核球の成熟度合は、 参考例 2に示 した巨核球 D N A量測定法で確認できる。
    [0027] 本発明の更に他の態様によれば、 通常使用される遺伝子ェ 学的技術を用いて該巨核球増幅因子を適当な宿主細胞に発現 させ、 これを回収し、 更に精製するこ と を含む該巨核球増幅 因子の製造方法が提供される。
    [0028] 即ち、 巨核球増幅を活性化する活性を有し、 且つ末梢血中 の血小板を増加させる活性を有する巨核球増幅因子を産生す る能力を有する、 各種の細胞例えば、 ヒ トの腎、 腸、 肺、 心 臓、 輸尿管、 皮膚、 包皮、 舌、 甲状腺、 胎盤、 子宮由来の細 胞を、 好ま しく はヒ ト胎児腎、 肺、 包皮由来の細胞を、 更に よ り好ま しく はヒ ト胎児肺由来の細胞から全 R N Aを抽出し、 更にこれによ り ポリ A + R N Aを精製する。 適当な発現用べ ク タ一、 好ま しく は真核生物発現用ベク ターとポリ A + R N A及びリ ンカ一を用いて c D N Aライブラ リ ーを作製し、 こ のライブラ リ ーを用いて適当な宿主細胞、 例えば、 大腸菌を 形質転換し、 その培養液よ リ プラ ス ミ ド D N Aを調製する。 このプラス ミ ド D N Aを用いて適当な宿主細胞を、 好ま しく は動物由来の細胞を、 更に好ま しく は、 サル由来の C O S細 胞を ト ラ ンスフエク ト し、 巨核球增幅因子の遺伝子を発現さ せ、 これを回収し、 更に精製するこ とによ リ 巨核球増幅因子 を製造するこ とができる。
    [0029] 次に、 その具体的一例について説明する。 適当量の巨核球 増幅因子を産生する細胞、 例えば、 ヒ ト胎児肺細胞好ま しく は 108 c e 11 sょ リ 、 R N Aアイ ソ レーショ ンキッ ト例えば米国、 ィ ンビ ト ロゲン社製のもの（力 タ 口 グ No. K1592- 01)を用いて、 付属のマニュアルに従い全 R N Aをグァニジンイ ソチオシァ ネー ト法にょ リ抽出し、 常法にしたがってポリ A + R N Aを 得る。 この際オリ ゴデック ス ー d T 3 0 (日本国、 日本合成 ゴム社製）を用いるこ とができ る。 通常上記方法によれば約 2 の全 R N Aが、 1ないし 2 gのポリ A + R N Aが得られ る。 次に岡山一バーグの方法に従い、 c D N Aライブラ リ ー を調製する。 例えば、 真核生物発現用ベクター 3'-o l igo (dT) -tai l ed pcDV-1 (ス ウェーデン国、 フアルマシア社製 No .27 - 4955-01 ) と上記で得たポリ A + R N A及び 3'- ol igo (dG)- ta i led p L 1リ ンカ一 （ス ウェーデン国、 フアルマシア社製 No. 27 -4957 ) を用レヽるこ とができる。 あるレヽは pcDL - SRひ 296を用 いてもよい。 得られた c D N Aライブラ リーを含む溶液を適 当数のプール、 好ま しく は 10〜200更に好ま しく は 50〜 100 のプールに分け、 それぞれについて大腸菌 M C 1 0 6 1 ( A T C C 5 3 3 3 8 ) への形質転換を行う。 形質転換した大腸 菌をアンピシ リ ン存在下で一晩培養する。 集菌、 溶菌後、 例 えばキアゲン- t ip- 100 (米国、 キアゲン社製） を用い、 付属 のマニュアルに従いプラス ミ ド D N Aを調製する。 得られた 組換え体 D N Aを、 例えばジェチルア ミ ノエチル一デキス ト ラ ン法 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 9.2.1-9. 2.6) によ リ 、 適当な宿主細胞、 好ま し く はサル腎細胞 C〇 S 1 細胞 （ATC CRL 1650 ) に導入した後、 W088/05053明細書、 実施例 2 に記載の方法とほぼ同様に して遺伝子を発現させる。 即ち、 適当な培養条件例えば 10%牛胎児血清を含む D— M E M培地 （米国、 フ ローラボラ ト リ ー社製） で、 37 °C、 40時間、 5% C O 2の条件で培養後、 無血清の D— M E M培地に交換し、 2日毎に 3回培養液を回収する。
    [0030] また本発明によれば、 巨核球増幅因子遺伝子を組込んだ発 現細胞を巨核球増幅因子の活性を指標にスク リ ーニングし、 巨核球増幅因子遺伝子をク ローニングする こ と もでき る。
    [0031] 即ち、 回収 したそれぞれの培地を濃縮した後、 液体培養に よ るァセチルコ リ ンエステラーゼ活性測定法等によ リ 巨核球 増幅因子活性を測定しこれを指標にして、 本物質遺伝子を含 むプールの絞 リ込みを行う こ と ができ る。 更に陽性であった D N Aについて、 再度大腸菌の形質転換を行ない、 得られる コ ロニー （約 2000値） を 10個程度を一ま と め と して培養し、 上記と 同様に して D N Aの調製、 C O S 1 細胞への導入、 発 現及びァセチルコ リ ンエステラーゼ活性測定を行ない、 二次 の c D N Aライブラ リーの絞リ込みを行う こ と もできる。 通 常本方法を数回繰リ返すこ とによ リ 、 該巨核球増幅因子活性 を発現する c D N Aプラス ミ ドを持つ大腸菌が単離される riayashi da，K. et a 1. 「 Hema topo ie t i c Factor」 l，No. 2 , 1 02- 108 ( 1990)) o
    [0032] 更にまた本発明によれば、 巨核球増幅因子の蛋白質一次構 造の一部をコー ドする遺伝子プローブを調製し、 これを用い てその巨核球増幅因子遺伝子をク ローニングするこ と もでき る。
    [0033] 更にまた本発明によれば、 ク ロ ーニングされた巨核球増幅 因子遺伝子を用いて、 例えば、 大腸菌、 酵母、 サルの腎細胞 ( C O S細胞） 、 チャイニーズハムス タ ーの卵巣細胞 （ C H O細胞） 、 マウス C 1 2 7細胞、 ヒ ト胎児腎細胞株、 カイ コ 細胞 S F 9等の宿主細胞を ト ラ ンス フ ク ト し、 更に効率的 に該巨核球増幅因子を発現させ、 これを回収し、 更に精製す るこ とによ リ 巨核球増幅因子を製造する こ とができる。
    [0034] 本発明による巨核球増幅因子蛋白質の製造方法において、 例えば細胞培養による製造の場合、 生産細胞による巨核球增 幅因子の産生が所望の生成量または日数に達したと きに、 培 養上清を回収する。 該巨核球増幅因子の分離 · 精製方法と し ては、 蛋白質化学において通常使用される方法、 例えば、 担 体によ る吸着法、 塩析法、 電気泳動法、 およびイオン交換、 ゲル濾過、 適当なリ ガン ドへのァフィ二ティ一を応用 した各 種のク ロマ ト グラフィ一法等を単独で、 または組み合わせて 使用できる。 ク ロマ トグラフィー法と して、 好ま しく は、 力 ルボキシメチル基を結合させたセ フ ァ ロースを用いる C Mセ ファ ロースカラムク ロマ ト グラフィー、 架橋したデキス トラ ンゲル等の粒子をもちいるゲル濾過カラムク ロマ トグラフィ 一、 色素吸着カラムク ロマ ト グラフィー、 本発明物質と特異 的に結合する抗体を結合させた抗体ァフィ二ティーカラムク ロマ ト グラフィ一を使用できる。
    [0035] このよ う にして得られる新規な巨核球增幅因子は巨核球の 増幅を活性化する活性を有し、 且つ末梢血中の血小板を増加 させる活性を有するものである。 該巨核球増幅因子は、 骨髄 幹細胞あるいは骨髄巨核球前駆細胞からの巨核球の分化、 増 殖並びに巨核球の成熟の研究用試薬と して、 また該巨核球増 幅因子単独で、 あるいは治療的に有効な量の該巨核球増幅因 子に製薬剤的に許容される担体、 希釈液および賦形剤から選 ばれる少なく と も 1 種を添加して適当な剤形と し、 医薬品と しても使用するこ とができる。 担体、 希釈剤および賦形剤と しては通常こ の分野で用いられているものを用いるこ とがで きる。 また該巨核球増幅因子、 I L _ l ， I L - 2 , I L - 3 , I L - 4 , I L - 5 , I L - 6 , I L - 7 , I L - 8 , I L - 9 , I L— 1 1 , GM— C S F , G— C S F， M— C S F , S C F， I F N s , L I F , T N Fおよび E P〇から選ばれる少 なく と も 1種の因子、 および製薬的に許容される担体、 希釈 液およぴ賦形剤から選ばれる少なく と も 1種を添加して適当 な剤形と し、 医薬品と して使用することができる。
    [0036] 本発明の巨核球増幅因子は、 ある種の血小板減少症、 例え ば抗癌剤投与後の血小板減少症、 放射線治療後の血小板減少 症、 巨核球増幅因子欠損による血小板減少症、 再生不良性貧 血の血小板減少症、 骨髄移植後の血小板減少症、 自己免疫疾 患の血小板減少症の治療及び Zまたは予防に用いるこ とがで きる。 また白血病の治療にも用いるこ とができ る。 更に血小 板輸血の代替、 補助剤と して、 あるいは輸血用骨髄細胞の i n V r 0での増殖培養にも用いるこ とができる。
    [0037] 本発明の巨核球増幅因子は、 注射剤と しても用いる こ とが でき る。 この場合は、 ショ 糖、 グ リ セ リ ン、 メ チルセルロー ス 、 カルボキシメ チルセルロース等の増粘剤、 各種無機塩の P H調整剤等を添加剤と して加えるこ とができ る。
    [0038] 本発明の巨核球増幅因子の成人 1 回当 リ の投与量は、 年齢、 性別、 体重、 症状などによって異なるが、 一般に 0 . 1 g〜 1 0 0 mgであ り 、 1 日 当 リ 1 回または必要に応じて数回投与する こ とができる。
    [0039] 発明を実施するための最良の形態
    [0040] 本発明をよ リ詳細に記述するために、 実施例にょ リ説明す るが、 本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものでは なレヽ。
    [0041] 参考例 1 巨核球増幅因子活性測定法
    [0042] 本発明によって得られる新規な蛋白質の巨核球増幅因子活 性は、 下記の 2つの方法 （ a ) 、 ( b ) で測定した。 ( a ) 軟寒天培養法による M e g — P O T活性測定法
    [0043] 骨髄細胞懸濁液の調製
    [0044] 以下の骨髄細胞懸濁液の調製法に用いる I M D M液 （ I s 0 c 0 V e s modi f icat ion of Dal 1 b e c c o s medium) (.ま、 粉末 丄 ] I D M ( 1 β 用） （米国、 ギブコ社製） に重曹 3. G 24 g、 iS — メ ル カプ トエタ ノ ール 3.04 β を加え、 Ρ Ηを 7.1に調製した後、 1 β にメ スアップし、 更に 50 I U/m βぺニシリ ン及び 50 μ g /m β ス ト レプ ト マイ シン （いずれもフ ローラボラ ト リ ーズ社製） を加えて調製したものである。
    [0045] 6〜 9週令の C 5 7 B Lノ 6マウス （雄） の大腿骨を採取 し、 その上部を切断し、 ΙΟπι β の ： 1 MDM液を入れた lOm fi の プラスチッ ク注射器 （ 2 2 G針） を用いて、 膝関節側から 10 Ommプラスチックディ ッ シュ中に、 勢いよ く 骨髄を押しだし た。 8 回 （ 1 9 G針 6 回、 2 2 G針 2回） のピペッティ ング 操作によ って、 細胞を分散した後、 15m £ のフ ァノレコンチュ ーブに移し、 非沈降性の細胞を採 リ 、 これを 1 ODI の I M D Μ液で 2回洗浄し、 最後にマ ウ ス 1 匹当 リ 2.5m £ の I MDM 液にサスペン ドし、 更によ く 分散させて得た骨髄細胞懸濁液 を次のコ ロ ニーア ツセィ の実験に供した。 細胞濃度は、 ト リ パンブル一 （米国、 フ ローラボラ ト リ ーズ社製） 染色にて血 球計算盤で測定した。
    [0046] コ ロニーア ツセィ
    [0047] 次の実験において用いるァセチルコ リ ンエステラーゼ染色 液と しては、 1 · 73 m Mヨ ウ化ァセチルチオコ リ ン、 0.5m M フェ リ シアン化カ リ ウム、 5mMクェン酸ナ ト リ ウム、 3m M 硫酸銅 （いずれも 日本国、 和光純薬社製） を含む 400m β の pH 6.0の 75 m Mリ ン酸緩衝液に溶解したものを用いた。
    [0048] 105個の骨髄細胞を 100mmプラスチックディ ッ シュ 中で、 15 v/v。/。と なる よ う に馬血清 （米国、 J . R.サイ エンテ ィ フ ィ ッ ク 社製） を加え、 更に I L— 3 (米国、 ジェ ンザィ ム社製） 50 n gまたは I L— 3含有 C O S 1 細胞培養上清を 1 V /v°/。と なる よ う に加えた 500 μ β の I M D Μ液培地中に被検液を加え、 0. 3%パク トァガー （米国、 ディ フ コ社製） で軟寒天状態と し、 37 °C、 5% C〇 2の条件下で 7 Θ間培養した。 I L一 3含有 C O S 1 細胞培養上清と しては、 マ ウ ス I L— 3 c D N Aを S V - 4 ◦ のプロモーターに連結したプラ ス ミ ド D N Aを用レヽ て、 C O S 1 細胞 （ATCC CRK 1650 ) を形質転換し、 W0 88/05 053、 実施例 2 に記載の方法と 同様に して発現させた、 I L 一 3含有培養上清を用いた。
    [0049] なお、 無血清状態で培養を行な う 際には、 上記の 15v/v%馬 血清含有 I M D M液培地の代 リ に、 1 w/ v%牛血清アルブミ ン、 360 iu g/m fi ヒ ト ト ラ ンス フ ェ リ ン、 0. 98 i g/m £ コ レステ ロ ール、 及び 50ng I L— 3 または 1 v/v% I L一 3含有 C O S 1 細胞培養上清を含む 50 G μ £ の I M D Μ液培地中で培養 した。 培養終了後、 ァガーディ ス ク をス ライ ドグラス上に移し、 乾 燥させた後、 2%ダルタルアルデヒ ドでァガ一ディ スク を固定 した。 固定後 リ ン酸緩衝生理食塩液 （ P B S ) で洗浄し、 了 セチルコ リ ンエステラーゼ染色液で巨核球の特異的染色を行 なった。 コ ロニー数は日本国、 ォリ ンパス社製 A H B型顕微 鏡を用いて、 6個以上の陽性細胞からなっている ものを 1 コ ロニーと して計数した。
    [0050] ( b ) 液体培養によるアセチルコ リ ンエステラ ーゼ活性測定 法
    [0051] 上記 （ a ) の測定法におけるのと同様に調製したマウス骨 髄細胞懸濁液に、 最終濃度 0.4 m Mとなるよ う にジィ ソプロ ピルフルオロ フォス フ ユー ト （ D F P ) (米国、 シグマ社製） を加え、 時々撹拌しながら室温で 2 0分置き、 骨髄細胞の内 在性のァセチルコ リ ンエステラーゼ活性を消去した。 細胞数 は上記と同様に血球計算盤計数した。
    [0052] 骨髄細胞懸濁液の細胞密度を 2.5 ~ 5 X 105 c e 11 s /m β となる よ う に D F Ρで内在性ァセチルコ リ ンエステ ラーゼ活性を消 去（J . Ce 11. Phys ioし JJ 159 ( 1985 ) ) した馬血清を 15 v/ v。/。含 む I P D M液に懸濁し、 9 6穴培養用ディ ッシュ （日本国、 住友べ一ク ライ ト社製） に、 1 穴当 リ（).2m £ を分注した。 試 料溶液を 20 μ β加え、 37 °C、 5% C O 2の条件下で 7 日間培養 した。
    [0053] 培養後、 遠心で細胞を沈め上清を除去した後、 各穴に 20 μ β の 5.6mMヨ ウ化ァセチルチオコ リ ン （米国、 シグマ社製） 、 及び 180 £ の 0.12M食塩、 ImMエチ レンジァミ ン四酢酸、 0.2%ト リ ト ン X— 1 0 0 を含む P H7.5の 50mMH e p e s 緩衝液を加えて、 室温で 3 〜 4 時間反応させた。 反応液の 20 X β を 96穴の蛍光測定用プレー ト （独国、 グライナ一社製） に移し、 160 μ £ の ImMエチレンジァ ミ ン四酢酸、 0.2%ト リ ト ン X— 1 0 0 を含む P H5.0の酢酸緩衝液及び 20 £ の 0.4 m M C P M (7-diethylamino-3-(,4'-male imidylphenyl)-4-m e t hy 1 couma r i n) (米国、 モ レキュ ラープローブ社製） のァセ トニ ト リ ル溶液を加えて、 室温で 1 時間反応させた。 ァセチ ルコ リ ンエステラーゼ活性は、 365nmの励起光によ る 450nmの 蛍光を P A N D E X F C A (米国、 バク ス ター社製） を、 用いて測定した。
    [0054] 測定を無血清条件で行な う 際には、 1.0%ニュー ト リ ドーマ — S P (独国、 ベー リ ンガーマンハイ ム社製） を含む I MD M液を用いて行った。
    [0055] 参考例 2 巨核球染色体 D N A含量測定法
    [0056] ヒ ト 由来細胞を培養して得られる本発明によ る巨核球増幅 因子の巨核球成熟促進活性は、 以下の方法で直接確認した。
    [0057] 上述のよ う に して作製したァセチルコ リ ンエステラーゼ染 色顕微鏡標本を、 D A P I (4'-6-diamidino-2-phenyl indo le) 染色液に約 1 0 時間浸漬して二重染色した。 コ ロ ニーを形成 している巨核球約 2 0 0個を無作為に抽出 し、 日本国オリ ン パス社製 B H 2落射型顕微鏡及び O S P — 1 細胞內 D N A蛍 光顕微測光装置を用いて、 それら細胞の染色体倍加数の分布 を測定した。 なお D A P I 染色液は、 下記の保存液 1 、 2、 3 を 0.5:98.5: 1.0m fi の割合で混合し、 ΙΟΟπι β と したも の を用いた。
    [0058] 保存液 1 ； D A P I lOmgを lOOOm fi の蒸留水に溶解したも の。
    [0059] 保存液 2 ; 0.1M食塩、 10mMエチ レンジァミ ン四酢酸を 含む P H7.4の lOmM ト リ ス ヒ ドロ キシメ チルァ ミ ノ メ タ ン緩衝液
    [0060] 保存液 3 ; 1M 2 — メ ルカプ トェチルァ ミ ン塩酸塩液 実施例 1 ヒ ト細胞培養法による巨核球増幅因子の生産
    [0061] 市販のヒ ト胎児肺正常二倍体細胞 （米国、 フ ロ ーラボラ ト リ ーズ社製） を 100 β容のガラスボ トルに、 105ce 11 s/m β の 密度で 2.5 mg /m β濃度のサイ トデッ ク ス I (細胞培養用 ビーズ 担体） （スウェーデン国、 フアルマシア社製） と共に植え込 み、 37°C、 5%C 02を含む空気中で、 生育培地と して 10°/。牛胎 児血清を含むメ ジゥム ME M培地を 60 β添加し、 60rpmの回 転数で撹はんしながら懸濁培養した。 8 日間培養し、 細胞を 充分に増殖させた後、 生理食塩液で細胞が接着したビーズ担 体を洗浄し、 血清を含まない 0.75%のプロテオースぺプ ト ン No. 3を含む、 あるいは含まない、 メ ジゥム 1 9 9培地 60 β に 置き換え、 60 r pmの回転数で撹はんしながら培養した。 3 日 目毎にこ の培地を交換しながら、 本発明物質を含む培養液 (condi t ioned medium) を回収した。 培養液を 10倍に濃縮し、 その中に含まれる巨核球増幅因子活性を、 参考例 1 ( a ) に 示した軟寒天培養法による M e g — P O T活性測定法によつ て評価した。 その結果を表 1 に示す。 なお参考までに、 いく つかの他の細胞の培養液についてもこれを評価した。 ヒ ト胎 児肺細胞は巨核球増幅因子を産生する能力を有する こ と、 ま たプロテオー スぺプ ト ン存在下で培養する と著しく 巨核球増 幅因子活性の産生量が増大するこ とが示された。
    [0062] (表 1 )
    [0063] 培養液試料 コロニ-数ハ 05ce 11 s ヒ ト胎児肺細胞培養液 1回目回収液 3 0
    [0064] (+ P P ) 2回目回収液 3 4
    [0065] 5回目回収液 2 6
    [0066] 10回目回収液 3 0
    [0067] ヒ ト胎児肺細胞培養液 1回目回収液 6
    [0068] (- P P ) 5回目回収液 6
    [0069] T H P— 1 (白血病細胞） 2
    [0070] H e p G 2 (肝癌細胞） 3
    [0071] T 2 4 (膀胱癌細胞） 3
    [0072] M C F 7 (乱癌細月包） 0
    [0073] 〔註〕 1 ) 回数は上記した培養 3 日 目毎の回数を示す。
    [0074] 2 ) P P ; プロ テオースペプ ト ン
    [0075] 各試料のコ ロニー数は、 アツセィ系に添加した I L— 3 の みの時に生じるコロニー数、 3 を差し引いて算出した。 実施例 2 巨核球増幅因子の精製 I
    [0076] 実施例 1 で得たヒ ト胎児肺正常二倍体細胞の培養上清 170 β に、 酢酸約 1. 1 JS を添加し、 P Hを 4 に調製した後、 濾過 によって細胞断片及び生じた不溶物を除去した。 予め 0.2M 食塩を含む P H 4.0の 20 m M酢酸緩衝液で充分に平衡化した カノレボキシメ チルセフ ァ ロース （ C Mセファ ロース ； ス ゥェ ーデン国、 フアルマシア社製） カラム （直径 9 cm X高さ 23.5 cm ) に吸着させ、 同平衡化緩衝液 13.5 β及び 0.4M食塩を含 む Ρ Η 4.0の 20m M酢酸緩衝液 6 β で洗浄後、 G .75M食塩及び 10m M塩酸リ ジンを含む Ρ Η 4.0の 20mM酢酸緩衝液 12 £ で 吸着している蛋白を溶出させた。 本操作によって巨核球増幅 因子活性を含む粗精製液 I と して 5.2 β の溶出液を得た。 培 養上清中に多量に含まれるプロテオースペプ ト ン成分は、 1% 以下にまで減少した。 図 1 に精製工程 1段目の C Μセフ ァ 口 ースク ロマ トグラフィーの結果の一例を示した。
    [0077] 溶出液には通常、 多量の組織プラス ミ ノーゲンァクチべ一 ター （ t P A ) が含まれているので、 これを特異的に除去し た。 即ち、 精製工程 2段目 と して、 上で得られた粗精製液 5. 2 β に 5 Μ水酸化ナ ト リ ゥム溶液を加え、 Ρ Ηを 7.0に調製し た後、 予め 0.5Μ食塩を含む ρ Η 7.5の 20m M ト リ ス塩酸緩衝 液で充分に平衡化した、 t P Aに対するモノ ク ローナル抗体 をセフ ァ ロ一スに結合させた （ 3 mg /m £ ゲル） 、 抗体カラム (直径 9cm X高さ 29cni) に通した。 本操作によって、 粗精製 液 Π 6.2 β を得た。 本カ ラムク ロマ ト グラフ ィ 一によ って、 巨核球増幅因子活性はほぼ定量的に回収された。 また粗精製 液 I に多量に含まれる t P A活性は除去された。
    [0078] 上で得られた粗精製液 Π 6.2 β を限外濾過モジュール S I Ρ - 1 0 1 3 ( 日本国、 旭化成社製） で 300m β にまで濃縮し、 これを予じめ 0.5Μの食塩を含む Ρ Η7.4の 20mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液で充分に平衡化したセフ ァ ク リ ノレ S — 2 0 0 (ス ウ ェーデン国、 フ アルマ シア社製） カ ラ ム （直径 10 cm X 高さ 90cm) でゲル濾過した。 流速は 800m β 時間で行なった c 巨核球増幅因子活性を有する分子量が約 25 の画分 290πι β を 粗精製液 ΙΠ と して分取した。 活性回収率は 10〜 20%であった。 図 2 に精製工程 3段目 のセフ ァ タ リ ル S — 2 0 0 カ ラ ムク ロ マ ト グラフィ 一の結果の一例を示した。
    [0079] 上で得られた粗精製液 ΙΠ 29 £ を限外濾過モジュール S I P - 1 0 1 3 ( 日本国、 旭化成社製） で 30m β にま で濃縮し、 1 0倍容の Ρ Η7.4の 20mM ト リ ス ー塩酸緩衝液を加え、 緩 衝液交換を行なった。 予め 50mM食塩を含む p H7.4の 20m M ト リ ス ー塩酸緩衝液で充分に平衡化した、 C Mセフ ァ ロ ー スカ ラム （直径 26 cm X高さ 7 cm ) に吸着させ、 約 40m β の同緩 衝液で洗浄した後、 約 80m β の 75m Μ食塩を含む同緩衝液 （ E 1 ) 、 約 80m fi の 0.15M食塩を含む同緩衝液 （ Ε 2， Ε 3 ) 、 更に約 80ιη β の 0.3Μ食塩を含む同緩衝液 （ Ε 4 ) でそれぞ れ溶出を行なった。 流速は 80m β /時間で行なった。 巨核球 増幅因子活性は E l， E 2 , E 3 の各画分に認められ、 その う ち E 2， E 3画分の活性は無担体等電点電気泳動によ リ 9 を超える等電点を有するこ とが確認できた。 一方 E 1 画分は ょ リ 中性の等電点を持つ成分を含んでいた。 E 2画分の内の 23m £ を粗精製液 I Vと して分取した。 活性回収率は 10〜30% であった。 図 3 に精製工程 4段目の CMセファ ロースカラム クロマ トグラフィ一の結果の一例を示した。
    [0080] 上で得られた粗精製液 I V23m £ に終濃度で 1 Mになるよ う に硫酸アンモニゥムを添加し、 予め 1 M硫酸アンモニゥム を含む P 117.0の2011^リ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液で十分に平衡 ィ匕した、 フエニルス一パーロースカラム （直径 0.5 cm X高さ 5 cm) (スウェーデン国、 フアルマシア社製） に吸着させ、 硫 酸ア ンモニゥム濃度 1.0〜0Mまでの'直線濃度勾配によ リ溶出 した （溶出量：約 30 m £ ) 。 硫酸ア ンモユウ.ム濃度が 0 Mに なった後に、 約 6m β の同緩衝液で溶出を行なった。 流速は 0. 5m β Ζ分で行なった。 8.3m β の巨核球増幅因子活性を有する 画分を粗精製液 Vと して分取した。 活性回収率は 50〜 70%で あった。 図 4 に精製工程 5段目 のフ エニルス一パーロ ース力 ラムク ロマ ト グラフィ一の結果の一例を示した。
    [0081] 上で得られた粗精製液 V 8.3πι £ を ρ Η 7.0の 5mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液に十分透析した後、 限外濾過中空糸を用いて ImjB に濃縮し、 等電点電気泳動用カラム （50m £容） （日本 国、 加藤祥ー商店製） を用いて、 3 ワ ッ ト定電力で 3 0時間、 グリ セロール密度勾配等電点電気泳動を行った。 なお両性担 体と して 1%アンホライ ン （ P H3.5— 10) (ス ウェーデン国、 フアルマシア社製） を用いた。 12. lm β の巨核球増幅因子活 性を有する Ρ Η9.5〜 11画分を精製標品と して分取した。 活 性回収率は 50〜70%であった。 図 5 に精製工程 6段目の等電点 電気泳動の結果の一例を示した。 総蛋白質量は 280 nmにおけ る紫外吸光係数 A 。=10と仮定して算出する と O. lm gであ つた。 精製度は 40000倍であった。 各精製工程における精製 度を表 2 に示した。
    [0082] (表 2 ) 名 容積（m ) 蛋白回 率（％) 活性回収率（％) 精製度（倍） 培養上情 170000 100 100 1
    [0083] S精製 c。a I 5200 0.35 60 170
    [0084] I 6200 0.21 57 270
    [0085] I 290 0.02 9.1 460
    [0086] IV 23 1.9 1900
    [0087] V 8.3 0.0002 1.2 6000 精製標 - 12.1 0.8 40000 実施例 3 巨核球増幅因子の物性
    [0088] 本物質の以下の諸性質を測定した。
    [0089] 分子量
    [0090] ( 1 ) ゲル濾過法
    [0091] 予め P B S で充分に平衡化したセフア ク リ ル S — 2 0 0 H R (ス ウェーデン国、 フアルマシア社製） カラム （直径 2.6 cm X高さ 94cm) を用い、 実施例 2 で得た精製標品を P B S で 展開 し （流速 27.6m β /h) 、 これを 4.6m β ずつ分画した。 各 画分の巨核球増幅因子活性は、 予めゲル濾過用低分子量マ ー カー蛋白質キッ ト （ス ウェーデン国、 フ アルマシア社製、 ゥ シ血清アルブミ ン（ B S A ) ； 67 k d、 ォブアルブミ ン ； 43 k d、 キモ ト リ プシノーゲン ； 25kd、 リ ボヌ ク レアーゼ A ； 14kd) 及びブルーデキス ト ラ ン 2000の溶出位置を確認し、 これら と の溶出位置の比較から分子量を測定した。 本物質は、 25kd土 8 kd付近にピーク をもって溶出 された。
    [0092] ( 2 ) SDS - PAGE法
    [0093] 15%〜 25%のポリ アク リ ルア ミ ドグラジェン トゲル （ 日本国、 第一化学社製） を用い、 実施例 2 で得た精製標品の分子量を 測定した。 約 0.1 g の精製標品を含む 10 β の SDS- PAGE用 試料をゲルへロー ドし、 P H 8.4の 0.025M ト リ ス、 0.192 M グ リ シン、 0.1 % S D S の組成の泳動緩衝液を用いて、 30 m A、 1.5時間で泳動した。 同時に SDS - PAGE用分子量マーカー蛋白 質キッ ト （ス ウェーデン国、 フアルマシア社製、 ホスホ リ ラ ーゼ b 94kd, BSA 67kd, ォブアルブミ ン 43 k d，カノレボニッ ク アンヒ ドラーゼ 30 k d，大豆 ト リ プシンイ ンヒ ビター 20.1 k d， α —ラク トアルブミ ン 14.4kd) を泳動し、 これら との泳動位 置の比較から、 分子量を測定した。 本物質は 28 k d ± 2 k dの位 置に泳動された。
    [0094] 等電点
    [0095] 実施例 2で得た精製標品 lm £ を 2mM燐酸緩衝液に対して一 晚透析し、 下記の開始溶媒に置換した後、 等電点ク ロマ トグ ラフィーを用いて、 下記条件で等電点 （ P I )を測定したと ころ、 本物質は P I > 9 と見積られた。 図 6 に等電点ク ロマ トグラフィ一の結果を示す。
    [0096] カラム ； モノ P H R 5 / 2 0 (ス ウェーデン国、 フ アルマ シァ社製）
    [0097] 開始溶媒 ； P H 9 , 3 の 0.075 M ト リ スー酢酸緩衝液 展開溶媒 ； 1 0 %ポ リ バッ ファー 9 6 (ス ウェーデン国、 フ アルマシア社製） 、 酢酸で p Hを 6.0と した。
    [0098] 流速 ； 1.0m β 分
    [0099] 熱、 及び ト リ プシン処理に対する安定性
    [0100] 実施例 2で得た精製標品を P B S 中で 100 °C、 10分間処理 し、 残存する巨核球増幅因子活性から安定性を評価した。 本 物質の活性は、 5%以下に失活し、 不安定であった。 また本物 質は、 0.125 mg /m β の ト リ プシンで 37 °C、 1時間の処理に対し ても感受性が高かった。 抗原性 .
    [0101] 本物質が既知のサイ トカイ ンと免疫学的に反応するかどう かを、 実施例 2 で得た精製標品を用いて検討した。 抗ヒ トェ リ ト ロポェチン抗体、 抗ヒ ト I L— 1 ひ抗体、 抗ヒ ト I L— I 抗体、 抗ヒ ト I L— 6 抗体、 抗ヒ ト I L— 7抗体 （全て 米国、 ジ ンザィ ム社製） を用い、 本物質の巨核球増幅因子 活性の中和実験を行った。 その結果、 本物質はこれらの抗体 で処理しても、 活性は低下せず、 これらの抗体と は反応しな いこ とが示された。 また本物質は、 抗 I L— 1 抗体カラム及 び抗 I L— 6 抗体カラム （米国、 エン ドジェン社製） に対し ても、 吸着性を示さなかった。 こ のこ と は、 本発明の巨核球 増幅因子がこれら既知のサイ トカイ ンと は免疫的に区別され る ものである こ と を示す。
    [0102] 実施例 4 巨核球増幅因子活性
    [0103] 本物質の巨核球増幅因子活性を、 実施例 2 で得た精製標品 を用いて参考例 1 ( a ) に記載の軟寒天培養法で検討した。 また I L一 6及び I L— 1 1 の活性と比較測定した。 C H O 細胞由来の r h i L— 6 は市販の物 （米国、 ジヱ ンザィ ム社 製） を用いた。 ま た h I L - 1 1 は C 〇 S 1 細胞由来の物 及び C H〇細胞由来の物を下記のよ う にそれぞれ調製し、 用 いた。
    [0104] ヒ ト胎児肺 （ H E L ) 細胞 c D N Aライ ブラ リ ーの作製
    [0105] ヒ ト胎児肺細胞約 2 X 10 8ょ リ 、 グァニジゥムイ ソチオシァ ネー ト変法に従い全 R N A約 200 gを抽出 した。 この際、 全 R N Aアイ ソ レーシ ョ ンキ ッ ト （米国、 イ ン ビ ト ロ ゲン社製） を用いた。 次いで、 全 R N Aよ リ オリ ゴテッ ク スによ リ ポ リ A付加 R NA約 1.6 gを単離した。 c D N A合成は岡山一 B e r g法にょ リ行った。 即ち、 こ のポリ A付加 R N Aを用い、 3 ' オ リ ゴ d Tテール付加 p C D V— 1 (ス ウェーデン国、 フ アルマシア社製） をベク タープライマーと し c D N A合成 キッ ト （独国、 ベー リ ンガー社製） にて、 添付のマニュアル に従い c D N A合成を行った。 合成反応終了後フ エ ノ ール抽 出、 エタ ノール沈澱を行い、 次にテー リ ングキッ ト （独国、 ベー リ ンガー社製） にて d Cテールを付加させた。 さ らにフ ェ ノ ール抽出、 エタ ノ ール沈澱後、 制限酵素 H i n d I I I で消化し、 反応終了後フ エ ノ ールク ロ 口 ホルム抽出 し、 エ タ ノ ール沈澱した。 次に 3 ' オリ ゴ d Gテール付加 p L— 1 H i n d I I I リ ンカ一 （ス ウェーデン国、 フ ァ ノレマシア社製） と 65°( 、 5分、 続いて 42°C、 60分加熱後、 室温にまで冷 却した。 次いで大腸菌 D N A リ ガーゼによ リ環状化させた。 その後、 R N a s e H、 D N Aポ リ メ ラーゼ I 、 D N A リ ガ ーゼによ リ R N A鎖を D N A鎖に変換させた。 このよ う に し て合成した c D N Aによ リ 、 大腸菌 K 1 2 M C 1 0 6 1 (米 囯、 ベックマン シティ ォブ ホープ メ ディ カル イ ン スティ テュー ト ょ リ 入手） を常法に従い形質転換した。
    [0106] H E L細胞 c D N Aラ イ ブラ リ ーからの— I L一— 1 1 のス ク リ P P 00372
    [0107] 30
    [0108] 一二ング
    [0109] 先ず、 次の配列を有するオリ ゴヌ ク レオチ ド ：
    [0110] 5 ' 一 C C G A G G G T C T G G G G A AA C T C— 3 ' を D N A合成機 （米国、 アプライ ドバイオシステム社製 D N Aシンセサイザー、 モデル 9 8 0 — A) を用いて常法どお リ 合成した。 ついで、 上記オリ ゴヌ ク レオチ ドの 5 ' 末端を T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼによ り リ ン酸化した後、 I L— 1 1合成 D N Aプローブと した。 本プローブにて、 上記にて 作製した c D N Aライ ブラ リ ーの コ ロニーハイ ブ リ ダイゼィ シ ヨ ンを実験書 （Mania sら、 Molecular Cloning 2nd. Edit ion 1.85、 1989年、 Cold Spr ing Harbor Laboratory) に従 つて実施した。 その結果、 約 70, 000個の形質転換体をスク リ 一二ングした と こ ろ、 本プローブと反応する数個のク ローン が得られた。 その う ちの 1ク ローンについて、 実験書に従い プラス ミ ド D N A ( p c D I L— 1 1 — 1 2 と称する） を調 製した。
    [0111] 塩基配列の決定
    [0112] 取得したプラス ミ ド上で I L— 1 1遺伝子のコー ド領域を 含むと推定される領域を中心に、 制限酵素を用い M l 3 m p 1 8 および M l 3 m p 1 9 のマルチク ローニング部位へサブ ク ローユング した。 次いで、 各々の塩基配列を蛍光 D N Aシ 一ケンサ一 （米国、 アプライ ドバイオシステム社の D NAシ 一ケンサ一 3 7 3 A ) を用い、 その添付プロ ト コールに従つ て蛍光プライマ ーサイ クルシーケンシングキ ッ ト （米国、 ァ プライ ドバイオシステム社製、 カタ ロ グ番号 4 0 1 1 1 9 ) を用いて決定した。 得られた塩基配列を ヒ ト I L一 1 1 c D N Aと比較したと こ ろ、 塩基配列から予想されるア ミ ノ酸の 一次構造はヒ ト I L一 1 1 のものと完全に一致した。 従って、 本プラス ミ ドが含んでいる遺伝子は確かにヒ ト I L _ 1 1 遺 伝子である と考えられた。
    [0113] プラ ス ミ ド p c D I L - 1 1 - 1 2の C O S — 1 細胞での発 C O S細胞への ト ラ ンスフエク シヨ ンは、 常法に従い、 以 下のよ う に実施した。 C O S — 1細胞 （A T C C C R L 1 6 5 0 ) を組織培養用ディ ッ シュ 中で、 10% (v/v) のゥシ胎 児血清 （以下 F C S と称する。 米国、 ギブコ社製） を加えた ダルベッ コ改変最小必須培地 （以下 D M E Mと称する。 米国、 フ ロ ーラボラ ト リ ーズ社製） を用いて、 37 °Cで 5% C O 2イ ン キュベータ一内で約 50%コ ンフルェン トになるまで培養した。 トラ ンスフエ ク シ ョ ン直前に、 添付のマニュアルどお り に調 製した P B S (—） （日本国、 二ッ スィ社製） で細胞を洗浄 し 4m fi の 10% ( v/v) の N u s e r u m I (米国、 コ ラボレイ ティ ブ社製） を加えた DM EMに置き換えた。 一方、 120 β の lOmg/m fi D E A E—デキス ト ラ ン溶液中に、 60 μ β の Τ B S に溶解させたプラ ス ミ ド P c D I L - 1 1 — 1 2 D N A ( 10 g) 溶液を滴下混合し D N A/D E A E—デキス ト ラ ン溶液を調製 した。 次いでこ の D NA/D E A E—デキス ト ラ ン溶液を先のディ ッシュ上へ均一にゆきわたる よ う に滴下 した後、 37 °Cで 5% C O 2イ ンキュベーター内で 4時間培養 し た。 培養上清を吸引除去後、 5m β の 10°/。 ( v/v) DM S O (米 国、 メノレク社製） を加えた P B S (― ) を添加し室温で 1 分 間放置した後、 吸引除去した。 さ らに 5m £ の P B S ( —） で 細胞を洗浄後、 7m fi の ΙΟΟμ Μク ロ 口 キン （ 日本国、 和光純 薬社製） および 2% (v/v) の F C S を加えた D M E Mを添加 し、 37 °Cで 5% C 02イ ンキュベーター内で 3時間培養した。 培養上清を除去し 1 Om β の P B S (—） で細胞を洗浄した後、 10% F C S を加えた D Μ Ε Μを添加し 37 °Cで 5 % C Ο 2ィ ンキ ュベータ一内で 2 日培養した。 以後、 血清を抜いた DMEM に置換し 2 日 ごと に培養上清を回収した。
    [0114] プラ ス ミ ド p c D I L - 1 1 - 1 2のチャ イ ニーズハムス タ 一卵巣 （ C H O) 細胞への導入と発現
    [0115] C H O— d h f r -細胞株はコ ロ ン ビア大学 D r · L . Ch a s i II , D r . G. U. Chas inょ リ入手した。 まず、 C H O— d h f r 細胞 5 X 105を組織培養用ディ ッシュ 中で、 増殖培地 （ 10%の F C S を加えた H a m ' s F— 1 2培地 （米国、 フ ローラボラ ト リ ーズ社製） にて 37°C1日培養した。
    [0116] 取得したプラス ミ ド P c D I L - 1 1 — 1 2 とプラス ミ ド p S V 2 - d h f r ( ATCC番号 37146 ) を F . L . G r a h amらの方 法 （F.L.Graham 「Virology」 52 , 456 ( 1973) ) に従い、 リ ン酸 カルシウム法にょ リ C H O— d h f r —細胞株への導入を行 つた。 3 日 間増殖培地にて培養後、 選択培地 （ D M E M ) ( 米国、 フローラボラ ト リ ーズ社製） にプロ リ ンが 1 50 g /m β 、 透析ゥシ胎児血清 （米国、 ギブコ社製） が 10%と なる よ う に 加えたもの） に置換した。 その後、 約 3日 ごと に培地交換を 行い、 約 2週間後には形質転換細胞コ ロニーが出現した。 数 個のコ ロニーをピッ ク ア ップし拡大培養後、 参考例 l ( a ) に従い、 その上清の巨核球増幅因子活性を測定したと こ ろ、 いく つかのク ローンで活性が検出された。 活性の検出 された ク ローンについて、 さ らに 20 η Μのメ ソ ト レキセー ト （Μ Τ X ) (日本国、 和光純薬社製） を含む選択培地にて、 約 2週 間培養 し Μ Τ X耐性コ ロニーを取得した。 数個のコ ロ ニーを ピッ ク ア ップし拡大培養後、 参考例 1 ( a ) に従い、 その上 清の巨核球増幅因子活性を測定したと こ ろ、 い く つかのク ロ ーンでさ らに活性の高まったものが検出された。 さ らに、 20 0 η Μに Μ Τ Xの濃度を上昇させ同様の操作にょ リ 耐性株を 取得した。 その う ちの 1 株を I L— 1 1 産生株と して以下の 実験に用いた。 この株を選択培地にてコ ンフルェン ト になる まで培養し、 次いで血清を抜いた選択培地にて培養後上清を 回収した。 培養上清中に S DS - PAG Eで約 2 3 k d の I L 一 1 1 が確認できた。
    [0117] 巨核球増幅因子活性の測定
    [0118] 巨核球増幅因子活性を軟寒天培養法で検討した。 結果を表 3 に示す。 I L — 6 (米国、 ジェンザィム社製） の M e g — P〇 T活性は lng/m β及び 50ng/m jSでははつき リ と した活性 が検知出来ず、 200ng/m β の高濃度を用いても、 I L一 3 の みの時のわずか約 3倍であった。 これに対し本物質の精製標 品は、 1 n g/m β で既に I L一 3 のみの時の約 5倍の活性を示し、 10ng/m β では約 40個以上ものコ ロニーを与え飽和していた。 また I L — l 1 の活性を C O S 1及び C H O細胞による発現 培養上清を用いて調べた。 I L — 1 1 によって得られる最大 コ ロニー数は I L一 6 ょ リ はやや高いものの、 本物質の 1/2 程度でぁリ明らかに活性が低いこ とが示された。 また本物質 は単独では、 巨核球増幅因子活性を示さなかった。 更にヒ ト 顆粒球コ ロ ニー刺激因子 （G — C S F ) 及びヒ トマク ロ ファ ージ刺激因子 （ M— C S F ) の活性も併せて測定したが、 こ れらの物質は I L一 3 に加えても巨核球増幅因子活性は実質 的に示さず、 また単独でも M e g — C S F活性を示すこと も なかった。 また I L — 3 のみ及ぴ I L一 3 +本物質 （10ng /m ΰ ) の試料について、 巨核球染色体 D Ν Α含量測定法によ リ 、 染色体倍数の測定を行ったと ころ、 I L — 3 のみの時に は 4 n〜 8 nの細胞が最も多かったのに対し、 本物質では 16 n以 上の細胞の割合が 60%以上に達し、 本物質の強い巨核球増 因子活性が示された。 (表 3 ) 試料 i コ ロニー -数
    [0119] IL- 3のみ (lOng/m β ) 3
    [0120] IL- 3 + 本物質 Ung/m β ) 1 6
    [0121] IL- 3 + 本物質（10ng/m £ ) 4 3
    [0122] 「
    [0123] Iし- 3 + 本物質（100ng/m Ά ) 4 2 本物質（10ng/m β ) 0
    [0124] e
    [0125] IL - 3 + I L-6 (lng/m £ B ) 3
    [0126] 1し- 3 + 5
    [0127] I L- 3 + 9
    [0128] 1し- 3 + I L-l 1 (COS" (1 μ β /m β ) 7
    [0129] IL- 3 + I L-l 1 (C0S1) (50 μ β /m β ) 2 4
    [0130] 1し- 3 + I L-l 1 (COS 1) (100 ju β /m β ) 2 0
    [0131] I L- 3 + I L-l 1 (CHO) (1 μ β /m β ) 8
    [0132] 1L- 3 + It-11 (CHO) (50 μ β /m fi ) 2 5
    [0133] Iし3 + J L-l 1 (CHO) (100 yu β /m β ) 2 6
    [0134] - 3 + 2
    [0135] GCSF (50ng/m β ) 0
    [0136] Iい •3 + CSF (lOng/m β ) 3
    [0137] GCSF (10ng/m β ) 0 更にまた、 本物質の巨核球増幅因子活性を液体培養による アセチルコ リ ンエステラーゼ活性 （ Ac h E act ivi ty) 測定法 によ リ評価した。 比較のために I L一 6 についても評価した この測定法においては、 IL- 3を Meg- CSFと して 2 β を加えた その時のコ ン ト ロールは、 I L- 3のみを添加した場合である。 結果を図 7 —（ a ) および図 7 —（ b ) に示す。 図 7 _ ( a ) および図 7 — ( b ) の左側の棒グラフは、 I L- 3を全く加えな い場合のデータである。 Relat ive ί 1 u o r e s c e n c eは、 被検試 料に何も加えない場合 （コン ト ロール） を 1 と した相対値で 示してある。 図 7 — ( a ) は無血清条件での培養結果を、 図 7 - (b ) は 15%の DFP処理した馬血清（HS)を含む条件での培 養結果を示す。 こ の測定方法においても本物質の強い巨核球 増幅因子活性が示された。
    [0138] 実施例 5 巨核球増幅因子の ト ロ ンボポェチン作用
    [0139] 本精製物質をマウス （ C 5 7 B L雄、 7週令、 一群 5匹） の腹腔内に 5 日間連続投与し、 最終投与後 3時間後に採血し て血小板数及び赤血球数を測定した。 表 5 に示したよ うに、 本物質は血小板数を危険率（P) 1%以下で有意に増加させ ト 口 ンボポェチン作用を示すこ とが明らかとなった。 なおこの時 赤血球数は増加しなかった。 表 4 において、 グループ 1及び 2 は本精製物質を一投与当 リ それぞれ 1 μ g及び 0.2 gを 150 μ g/m β の牛血清アルブミ ン（BSA)を含む PBS中に溶かしたも のを投与し、 グループ 3 にはコ ン ト ローノレと して、 BSAのみ を投与した。 (表 4 )
    [0140]
    [0141] 〔註〕 B S A : 牛血清アルブミ ン 実施例 6
    [0142] 以下に本発明の巨核球増幅因子を活性成分とする医薬組成 物の配合例と該医薬組成物の調製法を示すが、 本発明はそれ らの配合例に限定される ものではない。
    [0143] (配合例 1 )
    [0144] 精製した本発明の巨核球増幅因子 1 mg 精製ゼラチン 20mg マンニ ト ーノレ lOOmg 塩化ナ ト リ ウム 7.8mg リ ン酸ナ ト リ ウム 15.4 mg 上記成分を注射用蒸留水 2m β に溶解し、 無菌バイ アルに入 れ、 - 35°Cで真空度 0.075 TGr rで 35時間一次乾燥し、 次いで 3 0°C、 真空度 0.03 To r rで 5時間二次乾燥して、 注射用バイ ァ ルを製造した。 得られた組成物は、 投与直前に生理食塩水も し く はブ ト ゥ糖注射液 50 Om β に溶解して点滴静注するのに用 レヽ られる。 (配合例 2 )
    [0145] 精製した本発明の巨核球増幅因子 10 μ g
    [0146] ァルブミ ン 5mg
    [0147] マ ンュ ト 一ノレ 25mg
    [0148] 塩化ナ ト リ ウム 1.95mg
    [0149] リ ン酸ナ ト リ ウム 3.85mg
    [0150] 上記成分にて、 配合例 1 と実質的に同様の方法にょ リ注射 用パイアルを製造した。
    [0151] 図面の簡単な説明
    [0152] 図 1及び図 2は、 実施例 2の精製 1段目および精製 2段目 の各精製工程に於けるク ロマ トグラムを示し、 図 1 は精製ェ 程 1段目の CMセファ ロースカラムクロマ トグラフィー、 図 2 は精製工程 3段目のセファ タ リ ル S— 2 0 0カラムク ロマ ト グラフィ一の結果を示す。
    [0153] 図 3 は、 実施例 2の精製工程 4段目 の CMセフ ァ ロ ースカラ ムク ロマ トグラフィ一の結果を示す。
    [0154] 図 4は、 実施例 2の精製工程 5段目 のフ エニルス一パーロ ースカラムク ロマ トグラフィ一の結果を示す。
    [0155] 図 5 は実施例 2の精製工程 6段目の等電点電気泳動の結果 を示す。
    [0156] 図 6 は実施例 3の等電点ク ロマ トグラフィ一の結果を示す 図 7 — （ a ) 及び図 7 — ( b ) は、 本発明による巨核球增 幅因子及び IL- 6の巨核球増幅因子活性を、 液体培養によるァ セチルコ リ ンエステラーゼ活性 （AchE ac t iv i ty) 測定法に よ り評価した結果を示す。 図 7 — ( a ) は無血清条件での培 養結果を、 図 7 — ( b ) は 15%の DFP処理した馬血清（HS)を含 む条件での培養結果を示す。
    [0157] 産業上の利用可能性
    [0158] 本発明の巨核球増幅因子蛋白質は、 巨核球の増幅を促進し 且つ末梢血中の血小板を増加させる活性を有しており 、 その 活性は類似の活性を有する既知の諸因子に比べて強力である。 従って、 本発明の巨核球増幅因子蛋白質は、 そのまま単独で、 あるいはそれを活性成分と して含有する医薬組成物の形態で、 血小板減少症等の予防及び治療に有効に用いるこ とができる。
    权利要求:
    Claims'請求の範囲
    1 . 巨核球増幅を活性化する活性を有し且つ下記の諸性質を 有する実質的に純粋な巨核球増幅因子蛋白質。
    ( a ) 分子量 ： 2 5 , 0 0 0 ± 8 , 0 0 0 (ゲル濾過で測定）
    : 2 8， 0 0 0 ± 2， 0 0 0 ( SDS - P AGEで測定）
    ( ) 等電点（ p I ) ： p I > 9 (等電点ク ロマ トグラ ィー で測定）
    ( c ) ヒ トのエ リ ト ロポェチン、 イ ンターロイ キン 1 α、 ィ ンターロイ キン 1 /3 、 イ ンターロイキン 6及びイ ンターロイ キン 7 に対する各抗体を用いた巨核球增幅因子活性中和試験 において活性が実質的に低下しない。
    ( d ) 巨核球コ ロニー刺激因子活性を有さない。
    2 . ヒ ト細胞由来である請求項 1 に記載の巨核球増幅因子蛋 白質。
    3 . ヒ ト細胞が正常二倍体細胞である請求項 2 に記載の巨核 球増幅因子蛋白質。
    4 . 正常二倍体細胞が肺由来である請求項 3 に記載の巨核球 増幅因子蛋白質。
    5 . 動物細胞を培養し、 その培養液中に巨核球増幅因子蛋白 質を産生させ、 培養液から培養上清を回収し、 回収した培養 上清から巨核球増幅を活性化する活性を有し且つ下記の諸性 質を有する巨核球増幅因子蛋白質を分離 ·精製するこ とを含 む巨核球増幅因子蛋白質の製造方法。 ( a ) 分子量 ： 2 5， 0 0 0 ± 8， 0 0 0 (ゲル濾過で測定）
    ： 2 8， 0 0 0 ± 2， 0 0 0 (SDS - PAGEで測定） ( b ) 等電点（ p I ) ： p I > 9 (等電点ク ロマ トグラフィー で測定）
    ( c ) ヒ トのエ リ ト ロ ポェチン、 イ ンターロイ キン 1 ひ 、 ィ ンターロイ キン 1 )8 、 イ ンターロイ キン 6及びイ ンターロイ キン 7 に対する各抗体を用いた巨核球増幅因子活性中和試験 において活性が実質的に低下しない。
    ( d ) 巨核球コ ロニー刺激因子活性を有さない。
    6 . 動物細胞がヒ ト細胞である請求項 5 に記載の製造方法。
    7 . ヒ ト細胞が正常二倍体細胞である請求項 6 に記載の製造 方法。
    8 . 正常二倍体細胞が肺由来の細胞である請求項 7 に記載の 製造方法。
    9 . 該細胞の培養を培地中に巨核球増幅因子産生促進剤を添 加して行なう請求項 5 に記載の製造方法。
    1 0 . 巨核球増幅因子産生促進剤が獣肉ペプ ト ンである請求 項 9 に記載の製造方法。
    1 1 . 動物細胞がヒ トの肺由来の細胞である請求項 1 0に記 載の製造方法。
    1 2 . 動物細胞から
    ( a ) R N Aを抽出し、
    ( b ) 得られた該 R N Aよ リ ボリ A + R N Aを得、 ( c ) 発現用ベクター及び工程（b ) で得られたポリ A + R N Aとから c D NAライブラ リ ーを調製し、
    ( d ) 得られた c D N Aライブラ リーよ リ宿主細胞を用いて プラス ミ ド D N Aを調製し、
    ( e ) 得られたプラス ミ ド D N Aを用いて宿主細胞を トラ ン ス フェク ト し、
    ( f ) 該宿主細胞、 あるいは巨核球増幅因子活性を指標に該 宿主細胞をス ク リーニングして得た細胞を用いて、 巨核球增 幅因子蛋白質を発現させ、
    ( g ) 発現した該巨核球増幅因子を回収し精製する
    こ とを含む該巨核球増幅因子蛋白質の製造方法。
    1 3 . 治療的に有効な請求項 1 の巨核球増幅因子蛋白質、 及 ぴ製薬剤的に許容される担体、 希釈液および賦形剤少く と も
    1種を含有する医薬組成物。
    1 4. I L - 1 , I L - 2 , I L - 3 , I L - 4 , I L - 5 ,
    I L - 6 , I L - 7 , I L - 8 , I L - 9 , I L - 1 1 , G M— C S F , G— C S F , M— C S F， S C F， I F N s，
    L I F , T N Fおよび E P Oよ り なる群から選ばれる少なく と も 1種の因子を更に含有する請求項 1 3 に記載の医薬組成 物。
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    AU1435092A|1992-11-02|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1992-10-15| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU CA KR US |
    1992-10-15| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU MC NL SE |
    1992-12-10| DFPE| Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)|
    1994-06-08| 122| Ep: pct application non-entry in european phase|
    1994-11-26| NENP| Non-entry into the national phase in:|Ref country code: CA |
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